Production de mononucléotides β-nicotinamide (NMN) chez Escherichia coli

Abstrait

Le diabète est une maladie chronique et évolutive dont la prévalence augmente continuellement, augmentant la pression financière sur les systèmes de santé mondiaux. Récemment, la résistance à l'insuline, caractéristique du diabète de type 2, a été guérie chez des souris traitées avec le précurseur NAD ⁺ β-nicotinamide mononucléotide (NMN) , aucun effet toxique n'ayant été signalé. Cependant, NMN a un prix élevé, des méthodes de production plus rentables sont nécessaires. Cette étude propose une méthode de production biotechnologique de NMN chez Escherichia coli . Nous montrons que l'expression bicistronique de la nicotinamide phosphoribosyl transférase recombinante (Nampt) et de la phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) en présence de nicotinamide (NAM) et de lactose peut être une stratégie réussie pour une production rentable de NMN. Des vecteurs d'expression de protéines portant le gène NAMPT de Haemophilus ducreyi et la PRPP synthétase de Bacillus amyloliquefaciens avec la mutation L135I ont été transformés dans Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. La production de NMN a atteint un maximum de 15,42 mg par L de culture bactérienne (ou 17,26 mg par gramme de protéine) dans ces cellules cultivées en milieu PYA8 additionné de 0,1% de NAM et 1% de lactose.

introduction

Selon la Fédération internationale du diabète, le nombre d'adultes atteints de diabète de type 2 était de 425 millions en 2017, et il devrait atteindre 649 millions d'ici 2045. À l'échelle mondiale, 12% du budget des soins de santé (ou 727 milliards de dollars) sont dépensés sur le traitement du diabète. Des études récentes ont lié la résistance à l'insuline, la marque du diabète de type 2, au déclin de la fonction mitochondriale et à la diminution des niveaux de NAD ⁺ ainsi que du rapport NAD ⁺ / NADH, également observés dans le vieillissement. Le NAD ⁺ est présent dans tous les organismes vivants et est une coenzyme bien connue dans les réactions d'oxydoréduction. Les protéines désacétylases dépendantes de NAD ⁺ telles que SIRT1 et SIRT6 servent de capteurs métaboliques et régulent les voies en aval, qui finissent par restaurer la fonction mitochondriale et la sensibilité à l'insuline. Cette découverte étend le domaine de recherche des effets NAD ⁺ à d'autres maladies dégénératives associées au vieillissement, telles que les maladies cardiovasculaires, le cancer, l'arthrite, l'ostéoporose ou la maladie d'Alzheimer.

Le mononucléotide β-nicotinamide (NMN) est un intermédiaire de la biosynthèse NAD ⁺ produit à partir du nicotinamide (NAM) et du phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) par l'enzyme nicotinamide phosphoribosyl transférase (Nampt) (EC 2.4.2.12). Bien toléré, sans effets secondaires signalés lors d'une administration à long terme chez la souris et prévenant le déclin physiologique lié à l'âge, le NMN s'est révélé efficace pour traiter le diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, en inversant le dysfonctionnement mitochondrial associé au vieillissement et en sauvant l'effet du déclin lié à l'âge des cellules souches neurales.

Le NAM est généralement converti en NMN par des enzymes impliquées dans les voies de sauvetage NAD ⁺ , telles que Nampt. L'action de cette enzyme constitue la principale activité anabolique NAD ⁺ dans la cellule. La régulation du métabolisme et de la biosynthèse des nucléotides des mammifères ou des micro-organismes procède généralement par la consommation de PRPP. Le PRPP résulte du ribose-5-phosphate via les branches oxydantes et non oxydantes de la voie du pentose phosphate.

Chez les bactéries, le NAM est le plus souvent converti en acide nicotinique (NA) par la nicotinamidase, qui est intégrée dans la voie de Preiss-Handler, ce qui est également le cas d' Escherichia col . Chez les mammifères, aucune activité nicotinamidase n'a été signalée; Le NAM est converti en NMN par l'une des enzymes NAM phosphoribosyl transférase à la place. Bien que la plupart des bactéries manquent de NAM phosphoribosyl transférase, l'enzyme est exprimée dans Haemophilus ducreyi et Shewanella oneidensis .

Des organismes simples et polyvalents sur le plan métabolique, comme Escherichia coli , sont souvent utilisés en biotechnologie pour l'expression contrôlée de protéines ayant l'activité enzymatique souhaitée. L'ADN codant pour de telles enzymes est souvent introduit dans les bactéries par des vecteurs d'expression tels que le système pET de Novagen. Les vecteurs pET sont transformés en bactéries exprimant l'ARN polymérase T7, telles que E. coli BL21 (DE3). Le contrôle de l'expression des enzymes est obtenu à l'aide du promoteur lac , qui active l'expression uniquement en présence de lactose (également métabolisé comme source de carbone) ou de son analogue structurel synthétique, l'isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) ( non métabolisé, avec une concentration constante pendant le processus de croissance). Le métabolisme bactérien étant polyvalent, la variation de la source de carbone et la concentration des substrats enzymatiques à supplémentation moyenne sont des facteurs clés à prendre en considération dans un processus biotechnologique.

Visant à résoudre le problème actuel des prix élevés du NMN , dans nos travaux précédents, nous avons proposé une méthode de purification à partir de cellules bactériennes. Pour une optimisation plus poussée du processus, comme nous n'avons pu trouver qu'une seule méthode de production de levure publiée, cette étude propose une méthode de production biotechnologique NMN simple et rentable chez Escherichia coli .

Résultats

Transformation bactérienne

L'alignement de plusieurs séquences d'acides aminés généré pour le NadV putatif de Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 et Nampt de Mus musculus , présente une grande similitude (Fig.1 S1), faisant de toutes ces enzymes des candidats pour un processus biotechnologique.

Transformé E. les cellules coli avec les gènes nadV (NAMPT) portés par les plasmides pET28a (+) ont formé des colonies sur les plaques de gélose LB complétées par de la kanamycine. Aucune colonie n'a été détectée sur des plaques inoculées avec des cellules bactériennes non transformées. L'électrophorèse sur gel d'agarose d'ADN plasmidique isolé à partir de ces colonies a confirmé la présence de plasmides Nampt-PET28a, pET28a-soNadV ou pET28a-hdNadV dans E. coli DH5α (figure supplémentaire S2A, piste 2, 3, 4). Les bandes d'ADN correspondaient aux bandes d' E . coli BL21 (DE3) cellules pLysS (Fig. supplémentaire S2A, piste 6, 7, 8), qui ont été transformées avec les plasmides correspondants extraits directement de E. coli DH5α. Dans E non transformé. coli BL21 (DE3) cellules pLysS, utilisées comme contrôle négatif, la présence du plasmide pLysS a été confirmée par électrophorèse, une bande correspondant à la longueur connue de 4886 pb (figure supplémentaire S2A, piste 5) a été montrée sur gel d'agarose.

(Pour plus de données expérimentales, voir le site Web d'origine: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)